細(xì)胞質(zhì) RNA 提取實驗

材料與儀器

RNA
PBS 細(xì)胞裂解液 SDS 蛋白酶K 酚 氯仿 異戊醇 無水乙醇
離心機(jī) 培養(yǎng)箱

步驟

1. 對于單層培奍細(xì)胞
（1）每10 cm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞，用冰冷PBS洗滌3次。
（2）每次1 ml 然后用小體積PBS刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至冰浴的離心管中。
（3）300 g 離心5 min，棄上清，繼續(xù)冰浴。

2. 對于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
（1）300 g 離心5 min，棄上請。
（2）細(xì)胞以1/2原體積的冰冷重懸，再離心后棄上清。

3. 重懸細(xì)胞于375 μl 冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液，并置冰浴5 min。
4. 于4℃在微量離心機(jī)中離心2 min，將上清移至一個潔凈的已加有5 μl 20%SDS的管中，立即在旋渦混合器上振蕩。

5. 加入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白酶K，37℃溫育15 min。

6. 加入400 μl 酚/氯仿/異戊醇抽提，在旋渦混合器上振蕩用微量離心機(jī)離心，上清移至干凈的離心管中，重復(fù)抽提1遍。
7. 再以400 μl 氯仿/異戊醇抽棰，上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中。
8. 加入40 μl 3 mol/l 乙酸鈉緩沖液（pH7.5），再加無水乙醇，混勻后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃過夜。

9. 用微量離心機(jī)4℃離心15 min 加人1 ml 75%乙醇/25% 0.1 mol/l乙酸鈉（pH5.2）冼滌沉淀。
10. 干燥后用100 μl 處理過的水重溶沉淀，取10 μl RNA稀釋于1 ml 水中，測A280和A260，其與的RNA可在-70℃貯存。

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