Takara RR047A（PrimeScript™ RT Master Mix）反轉錄步驟及其原理

這款試劑盒是一款性能優異、操作非常簡便的預混式反轉錄試劑，它將所有所需組分（除模板RNA和RNase Free水外）預先混合在一起，大大減少了操作步驟和污染風險。

Takara RR047A 操作步驟：

以下是標準的操作流程，非常簡潔。在進行操作前，請務必在冰上進行，并使用RNase-Free的槍頭和試管。

 實驗前準備：

1.  RNA模板： 確保RNA質量好，無降解，無基因組DNA污染。建議使用前用DNase I處理RNA樣本。

2.  試劑解凍： 將RR047A Master Mix置于冰上wanquan解凍，使用前輕輕渦旋混勻，避免產生氣泡。

 第一步：配制反應體系

在一個無菌、無RNase的微量離心管中，按以下順序和用量加入各組分：

總體積： 20 µL

計算示例： 如果你要加入 500 ng 的 RNA（濃度為 100 ng/µL，則需要 5 µL），那么計算如下：

   5× Master Mix： 4 µL

   RNA： 5 µL

   RNase Free dH?O： 20 - 4 - 5 = 11 µL

注意： 輕輕用移液器吹打混勻，短暫離心收集液滴至管底。

 第二步：進行反轉錄反應

將配制好的反應管放入PCR儀或水浴鍋中，按以下程序運行：

1.  37°C for 15 分鐘 （反轉錄反應）

2.  85°C for 5 秒 （反轉錄酶失活反應）

3.  4°C 保持 （暫時保存）

程序解讀：

   37°C， 15分鐘： 這是反轉錄酶合成cDNA的最佳溫度和時間。

   85°C， 5秒： 這是一個快速的熱失活步驟，用于滅活反轉錄酶，防止其在后續的qPCR反應中干擾Taq酶的活性。這是RR047A的一個重要優點，無需復雜的純化步驟即可直接用于qPCR。

 第三步：產物保存與使用

   反應結束后，將得到的cDNA溶液置于冰上，可立即用于后續的PCR或qPCR實驗。

   若需長期保存，請置于 -20°C 冰箱。避免反復凍融，建議分裝保存。

 注意事項：

1.  RNA質量： 這是實驗成功的首要條件。確保RNA的完整性（通過瓊脂糖凝膠電泳檢查），并且A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明純度良好。

2.  無基因組DNA污染： 如果后續進行qPCR并需要高精度定量，強烈建議在反轉錄前用gDNA Eraser（Takara的另一款產品）處理RNA樣本，以ce di去除基因組DNA。

3.  無RNase操作： 全程使用RNase-free的槍頭、離心管和試劑，佩戴手套，防止RNase污染導致RNA降解。

4.  精確加樣： 確保所有組分的加樣量準確，尤其是Master Mix和RNA模板。

5.  陰性對照： 建議設置一個無酶對照（No-RT Control），即用等量的水代替Master Mix。這個對照在后續qPCR中用于檢測是否有基因組DNA的殘留擴增。

 總結

Takara RR047A（PrimeScript RT Master Mix） 的核心優勢在于其預混形式和快速熱失活特性。它將復雜的多組分混合步驟簡化為“一步加樣"，并通過短短5秒的85°C加熱即可滅活酶活，使得從RNA到cDNA再到qPCR的整個過程可以無縫、高效、高通量地進行，極大地提高了實驗的重復性和便捷性，特別適用于基因表達分析（qRT-PCR）研究。

Takara代理——天津益元利康生物科技有限公司

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