CCK8實驗注意事項

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的進行細(xì)胞增殖和毒性分析。

基本原理：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓liu酸2甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細(xì)胞增殖和毒性分析。

用途：藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。

1、當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μL培養(yǎng)基)。

2、酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

3、CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。

4、CCK-8在0~5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。

5、當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。

6、在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

7、金屬對CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會100%抑制。

8、懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間。

天津益元利康生物科技有限公司

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