如何降低非特異性擴(kuò)增？

一、擴(kuò)增方式

擴(kuò)增方式一般有兩種，對稱擴(kuò)增和不對稱擴(kuò)增。

1、對稱擴(kuò)增

使用等量的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物量隨著PCR循環(huán)呈指數(shù)增長，一般的PCR，使用的都是這種方式。

由于TaqDNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性，在PCR擴(kuò)增的過程中會水解探針，導(dǎo)致探針被耗盡，無法用于熔曲分析；若使用抗酶切修飾的探針，可一定程度降低水解，但由于探針阻礙了聚合酶通過，擴(kuò)增效率會大幅下降。

對稱擴(kuò)增產(chǎn)生的互補(bǔ)雙鏈，會與探針競爭結(jié)合靶序列，不利于探針結(jié)合到靶序列上，熔曲分析可能會出現(xiàn)異常。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高

缺點(diǎn)：一般搭配使用媒介探針進(jìn)行檢測，而其他類型探針由于被切割而無法使用。

2、不對稱擴(kuò)增

上下游引物中，有一條引物為過量使用，一條引物xian量使用，在PCR擴(kuò)增的前期，擴(kuò)增產(chǎn)物量呈指數(shù)增長，待xian量引物耗盡，擴(kuò)增產(chǎn)物量呈線性增長，產(chǎn)生大量的單鏈用于探針的結(jié)合和熔解曲線分析。

LATE-PCR方法中，由于考慮到引物濃度對引物Tm值的影響，xian量引物由于濃度低，對模板的結(jié)合效率下降，從而影響不對稱擴(kuò)增前期的擴(kuò)增效率，因此對xian量引物的Tm值進(jìn)行了增加（即加多幾個(gè)堿基）。

優(yōu)點(diǎn)：不會消耗探針，探針可用于后續(xù)熔解曲線分析

缺點(diǎn)：靈敏度低，一般用于基因檢測，不適用于病原檢測（病原檢測需要高靈敏度）

二、如何降低非特異性擴(kuò)增？

1、HANDS技術(shù)（Homo-Tag Assisted Non-Dimer System，同源加尾無二聚體系統(tǒng)）

通過對引物添加標(biāo)簽，當(dāng)形成引物二聚體后，由于首尾的序列互補(bǔ)，會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，不再作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。

2、DPO引物（Dual Priming Oligonucleotide，雙啟動寡核苷酸）

DPO引物主要由三個(gè)部分組成，長的 5'端片段、短的3'端片段、中間起連接作用的聚脫氧次黃嘌呤(poly I)。由于脫氧次黃嘌呤與天然堿基結(jié)合較弱，因此相當(dāng)于與模板DNA形成了一個(gè)氣泡結(jié)構(gòu)。

即使DPO引物的較長的 5'端部分結(jié)合到了非靶序列部位，但由于熱力學(xué)限制，3’端部分阻止了非特異結(jié)合并有效地阻斷了延伸。同樣由于熱力學(xué)限制，單獨(dú)的3'端部分在PCR退火溫度下不能結(jié)合到靶序列上。從而減少引物二聚體的擴(kuò)增。

3、touch-down技術(shù)

即降落PCR，在退火階段，采用逐級降溫的方式，能有效減少非特異性擴(kuò)增。溫度較高時(shí)，由于非特異性結(jié)合的結(jié)合力較弱，不利于非特異性擴(kuò)增，特異性擴(kuò)增占優(yōu)勢。

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