WB實驗之內參蛋白的選擇

在進行WB（Western Blot）實驗時，選擇合適的內參確實至關重要。內參的主要作用是像一把“尺子"，用來衡量和校正每個樣本的上樣量，以及在上樣過程中可能產生的實驗誤差。這樣，我們就可以更加確信實驗結果的準確性，因為它們已經經過了內參的校正。

一、選擇內參需要遵循的原則？

1. 樣本種屬來源

匹配性原則：內參蛋白的選擇應基于實驗樣本的物種來源。對于哺乳動物細胞和組織樣本，常用的內參包括β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B等。這些蛋白在哺乳動物細胞中表達穩定，適合作為內參。

跨物種反應性：當研究涉及多個物種時，應選擇具有廣泛物種反應性的內參，或根據具體物種選擇特異性內參。

2. 目的蛋白分子量

分子量差異：為了避免信號干擾和圖像解析的復雜性，內參蛋白的分子量應與目的蛋白保持顯著差異。一般建議內參蛋白與目的蛋白的分子量相差5kDa以上。

3. 目的蛋白表達部位

亞細胞定位：根據目的蛋白在細胞內的定位選擇相應的亞細胞器內參。例如，核蛋白檢測可選擇Lamin A、Lamin B、Histone H3等核內參；膜蛋白檢測可選擇ATP1A1等膜內參；線粒體蛋白檢測可選擇VDAC1和COX IV等線粒體內參。

表達一致性：確保內參蛋白與目的蛋白在細胞內的表達部位一致，以提高實驗結果的內部一致性。

4. 實驗條件影響

穩定性評估：在選擇內參時，需要充分了解實驗條件對內參蛋白表達的影響。某些實驗條件（如缺氧、糖尿病、藥物處理等）可能會導致特定內參蛋白的表達水平發生變化。

適應性選擇：選擇那些在實驗條件下表達穩定、受影響較小的內參蛋白。例如，在缺氧條件下，GAPDH的表達可能會增高，因此不適合作為內參；而在凋亡實驗中，Lamin等也可能不適合作為內參。

5.文獻參考和實驗驗證

文獻查閱：查閱相關文獻了解不同內參蛋白在不同實驗條件下的表現，以獲取有價值的參考信息。

二、選擇內參的注意事項

選擇內參的注意事項主要包括考慮目的蛋白分子量、種屬特異性、蛋白表達位置、試驗處理條件對內參表達的影響，以及確保內參蛋白的穩定性。?

?1. 目的蛋白分子量?：

選擇內參抗體時，應考慮目的蛋白分子量的大小，通常應保證目的蛋白與內參蛋白分子量相差5KDa以上。例如，如果目的蛋白分子量為45KDa，則不宜選擇分子量為42KDa的β-actin作為內參，而可以考慮選擇分子量為36KDa的GAPDH作為內參?。

?種屬特異性?：不同種屬的樣本內參蛋白不同。例如，哺乳動物的組織或細胞樣本通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH等，而植物來源的實驗樣本則可能選擇Plant actin、Rubisco等?。

?2. 蛋白表達位置?：

內參的選擇還需考慮蛋白的表達部位。不同的表達部位可能需要不同的內參蛋白。例如，細胞骨架相關的研究不宜選擇β-actin作為內參，因為β-actin是細胞的一種重要骨架蛋白，其表達量非常豐富，但在某些特殊情況下，如脂肪組織中，β-actin的表達量很少，此時β-actin就不再適用?。

?3. 試驗處理條件?：

試驗處理條件對內參表達的影響也是一個重要的考慮因素。例如，GAPDH是糖酵解過程中的酶，關于糖代謝的研究（如糖尿病模型）中不宜選擇GAPDH作為內參，因為某些細胞中缺氧也會影響GAPDH的表達。此外，腫瘤組織中的GAPDH相對于正常組織是高表達的，有文獻報道GAPDH可以作為腫瘤標志物，因此在比較腫瘤組織與正常組織時，也不宜選擇GAPDH作為內參?。

?4. 內參蛋白的穩定性?：

內參蛋白的穩定性是選擇內參的關鍵因素之一。內參蛋白應能在不同的實驗條件下保持相對穩定的表達水平，以確保實驗結果的準確性。內參蛋白的穩定性可以通過實驗前的樣品前處理來保證，但在某些特殊條件下，內參蛋白的表達也可能發生變化?。

三、常用內參