天根感受態細胞(CB104-01)現貨供應

感受態細胞轉化效率高達 108 cfu/µg，具鏈霉素抗性，其轉化后單菌落的生長數多，生長速度比 DH5α 略快，相同培養時間內生長的菌斑略大于DH5α。適用于高效的 DNA 克隆和質粒擴增。能保證高拷貝質粒的穩定復制。

操作步驟：

使用前請先在漂洗液PW中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標簽。

1. 柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000 rpm（~13,400×g）離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（使用當天處理過的柱子）

2. 取1-5 ml過夜培養的菌液加入離心管中，12,000rpm （~13,400×g）離心1 min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。

3. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250μI溶液P1（請先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器徹di懸浮細菌細胞沉淀。

注意：如果有未徹di混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。

4. 向離心管中加入250μl溶液P2，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。

注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組DNA，造成提取的質粒中混有基因組DNA片斷。此時菌液應變得清亮粘稠，所用時間不應超過5min，以免質粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹di，應減少菌體量。

5. 向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉淀。12,000rpm（~13,400×g）離心10min，用移液器小心地將上清轉移到過濾柱CS（過濾柱放入收集管中），注意盡量不要吸出沉淀。

注意：P3加入后應立即混合，避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

6. 12,000 rpm（~13,400×g）離心2 min，小心地將離心后收集管中得到的溶液轉移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），（如果過濾柱中有殘余的液體說明步驟5吸取的上清中雜質過多，可以延長離心的時間；如果離心后收集管底部有少量的沉淀，盡量的吸取上清）。

7. 12.000 rpm （~13,400×g）離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

8.向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm （~13.400×g）離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

 9. 向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

10.重復操作步驟9。

11.將吸附柱CP3放入收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）離心2 min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP3開蓋，置于室溫放置數分鐘，以徹di晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

12.將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100μI洗脫緩沖液TB，室溫放2min,12,000rpm（~13,400×g）離心2min，將質粒溶液收集到離心管中。

注意：為了增加質粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，重復步驟12。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用ddH20做洗脫液，應保證其pH值在7.0-8.5范圍內，pH值低于7.0會降低洗脫效率。洗脫緩沖液體積不應少于50μl，體積過小影響回收效率。且DNA產物應保存在-20°C，以防DNA降解。

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