碧云天 LipoInsect轉染試劑(C0551-7.5ml)現(xiàn)貨供應

碧云天 LipoInsect轉染試劑(C0551-7.5ml)是一種基于陽離子脂質體等最新轉染技術的非常高效的新型昆蟲細胞轉染試劑。本產品轉染效率高、操作簡單、細胞毒性低、重復性好，達到了國際最主流昆蟲細胞轉染試劑的轉染效果。

本產品適用于將pFastBac1等桿狀病毒表達載體質粒DNA轉染到Sf9、Sf21和High Five™等昆蟲細胞以用于Bac-to-Bac®、BaculoDirect™和InsectSelect™表達系統(tǒng)的蛋白表達。LipoInsect™轉染試劑操作簡單，使用方法和常用的Cellfectin® II Reagent完quan一致。LipoInsect™轉染試劑轉染過表達質粒后，通常96小時后達到較高的蛋白表達水平。LipoInsect™轉染試劑的轉染效果可以通過轉染表達EGFP等熒光蛋白的bacmid進行快速鑒定。

操作使用：

1. Bacmid轉染：

a. 昆蟲細胞培養(yǎng)：按照每孔約80萬Sf9或Sf21細胞(具體的細胞數(shù)量據(jù)細胞類型、大小和細胞生長速度等而定)用正常的細胞培養(yǎng)液接種到六孔板內，使細胞密度能達到約70-90%。在27-28℃培養(yǎng)，后續(xù)轉染和培養(yǎng)也在該溫度下進行。

b. 15分鐘后，將正常的細胞培養(yǎng)液更換為平板培養(yǎng)液(含1.5%胎牛血清不含抗生素的SFX-INSECT培養(yǎng)液)每孔0.8ml。

c.對于待轉染的六孔板中每一個孔的細胞，取兩個潔凈無菌離心管，分別加入100μl不含血清和抗生素的SFX-INSECT昆蟲細胞培養(yǎng)液用于稀釋bacmid和轉染試劑。其中一管加入16μg bacmid，并用槍輕輕吹打混勻；另一管加入8μl LipoInsect™轉染試劑，用槍輕輕吹打混勻，或者輕微Vortex混勻，但不可離心。稀釋的bacmid和轉染試劑室溫靜置約2-5min(最多不得超過30分鐘)。隨即把稀釋的bacmid用移液器輕輕加入到稀釋的LipoInsect™轉染試劑中，輕輕顛倒離心管或者用槍輕輕吹打混勻，室溫靜置15-30分鐘。

d. 按照六孔板每孔200μl LipoInsect™轉染試劑-bacmid混合物的用量，均勻滴加到整個孔內，隨后輕輕混勻。

e. 為達到最高的轉染效率，細胞在轉染后培養(yǎng)3-5小時后宜更換為新鮮的wan全培養(yǎng)液(對于Sf9細胞，推薦在轉染4小時后更換培養(yǎng)液)。

f. 繼續(xù)在27-28℃培養(yǎng)約96小時后，收集每孔的培養(yǎng)液，500g離心5分鐘，獲得的上清即為P1代桿狀病毒(病毒滴度通常為1×106~1×107 pfu/ml)。P1代病毒4℃避光保存，如果包裝病毒時的細胞培養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)液宜添加胎牛血清至終濃度為2%以保護病毒被蛋白酶降解。P1代病毒近期不使用的情況，可以適當分裝后-80℃長期保存。盡量避免反復凍融病毒，反復凍融可能導致病毒滴度下降10-100倍。

g. 為獲得更高滴度的桿狀病毒，可以使用P1代病毒感染Sf9或Sf21細胞等來獲得P2代桿狀病毒(病毒滴度通常為1×107 ~1×108pfu/ml)。具體操作請參照昆蟲細胞Bac-to-Bac Baculovious expression system的相關操作規(guī)程。大致的步驟為使用P1代病毒感染2×106個貼壁約1小時的Sf9或Sf21細胞，推薦的病毒的MOI為0.05-0.1，過高的MOI會導致獲得的病毒質量下降。27-28℃培養(yǎng)48小時后，同步驟f收集每孔的培養(yǎng)液，隨后500g離心5分鐘，獲得的上清即為P2代桿狀病毒。P2代病毒的保存條件同P1代。由于桿狀病毒在每一代的擴增過程中均易出現(xiàn)缺少突變，因此推薦最多擴增至P3代病毒。

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