研究蛋白質(zhì)相互作用的方法有哪些？

相當(dāng)多的蛋白質(zhì)行使功能的時(shí)候并不是單打獨(dú)斗的，蛋白質(zhì)們通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用形成復(fù)合體然后進(jìn)行工作。因此，研究蛋白質(zhì)的相互作用成為研究蛋白質(zhì)功能和作用機(jī)制的最為重要的環(huán)節(jié)之一。那么你知道研究蛋白質(zhì)相互作用的方法有哪些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、酵母雙雜交系統(tǒng)

原理：很多真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分割開(kāi)的結(jié)構(gòu)域，即DNA特異結(jié)合域（DNA-binding domain, BD）與轉(zhuǎn)錄激活域（Transcriptional activationdomain, AD）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響，但一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，否則無(wú)法完成激活功能。

將兩待測(cè)研究蛋白（蛋白X與蛋白Y）分別與BD、AD結(jié)構(gòu)域構(gòu)建融合質(zhì)粒。將構(gòu)建好的兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母細(xì)胞中表達(dá)，如果兩蛋白之間不存在相互作用，則下游基因（報(bào)告基因）不會(huì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)；如果兩個(gè)蛋白存在相互作用，則BD與AD兩結(jié)構(gòu)域空間上很接近，從而下游基因（報(bào)告基因）得到轉(zhuǎn)錄。判斷通過(guò)報(bào)告基因表達(dá)與否，即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用。

用酵母雙雜交系統(tǒng)能夠快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用，并能尋找、分離與已知蛋白相互作用的配體，在研究抗原和抗體相互作用、發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的新功能、篩選藥物作用位點(diǎn)及藥物對(duì)蛋白互作影響、建立基因組蛋白連鎖圖等方面應(yīng)用廣泛。

二、免疫共沉淀

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究?jī)蓚€(gè)蛋白相互作用的經(jīng)典方法。

原理：基于抗體與抗原（靶蛋白）之間的特異性結(jié)合，此時(shí)如果樣品溶液中存在能與靶蛋白相互作用的目的蛋白，會(huì)一同被拉下來(lái)，隨后利用SDS-PAGE，Western Blot等方法對(duì)得到的目標(biāo)蛋白進(jìn)行分析，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。

三、免疫熒光共定位

將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來(lái)研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。一般用來(lái)驗(yàn)證2種或3種蛋白是否存在共定位關(guān)系。

由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。兩種不同的蛋白使用不同屬性的不同顏色熒光標(biāo)記后，通過(guò)觀察顏色的變化確定是否有共定位，也可以使用軟件進(jìn)行分析。

該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問(wèn)題尚未完quan解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。

四、Pull-down實(shí)驗(yàn)

Pull-down實(shí)驗(yàn)，又稱拉下實(shí)驗(yàn)，是一種體外親和純化技術(shù)。（這個(gè)實(shí)驗(yàn)跟免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)很像，不同的是免疫共沉淀是在細(xì)胞里進(jìn)行的。）

原理：將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose），但細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)該基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有被吸附的“雜質(zhì)"則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或洗脫條件而回收下來(lái)。

為了更有效地利用pull down技術(shù)，可以將待純化的蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)，即將“誘餌"蛋白與一種易于純化的配體蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白。

五、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)

雙分子熒光互補(bǔ)（Bimolecular fluorescence complementation, BiFC），該技術(shù)是利用熒光蛋白的特點(diǎn)來(lái)研究蛋白的相互作用。

熒光蛋白可從特定的位點(diǎn)被分開(kāi)，產(chǎn)生兩個(gè)非熒光活性片段即N端片段（N-fragment）和C端片段（C-fragment）（VN及VC）。當(dāng)兩片段分別被融合到相互作用的蛋白上時(shí)，會(huì)因蛋白的相互作用力而被拉近、發(fā)生互補(bǔ)從而重新構(gòu)建成有活性的熒光蛋白并在激發(fā)光下產(chǎn)生熒光。因此利用熒光顯微鏡就可以直接通過(guò)觀察熒光有無(wú)來(lái)判斷蛋白是否發(fā)生相互作用。

這是在活細(xì)胞中觀察蛋白相互作用的很好的方法。

這個(gè)方法還是存在假陽(yáng)性的，細(xì)胞里大量表達(dá)的分段的黃色熒光蛋白（YFP）可能會(huì)不受研究蛋白的結(jié)合與否而自己結(jié)合在一起，所以陰性對(duì)照的使用非常重要。

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