ELISA實驗結果異常的因素有哪些？

ELISA運用了免疫學原理和化學反應顯色原理，需要將抗原或抗體預包被在固相載體表面，使后來形成的抗原-抗體-酶（熒光基團）-底物復合物黏附在載體上，通過檢測OD值或發光值，來檢測靶蛋白的含量。ELISA適合用于定量檢測胞外的分泌性蛋白，檢測大分子抗原和特異性抗體等。那么ELISA實驗結果異常的因素有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、樣品

樣品是檢測的前提，樣品質量會直接影響實驗結果?？梢杂肊LISA來檢測的樣品很多，根據檢測項目不同可以是血清、血漿、唾液、尿液等，但大部分還是以血清為樣品。作為血清樣品，應避免溶血，溶血可能會增加非特異性顯色，導致結果出現誤差。

血清樣品的反復凍融會使血清中的抗體效價下降，所以需要多次檢測的血清樣品，如在5d內檢測完，可4℃保存，如需長時間檢測，可進行分裝凍存。樣品如被細菌污染腐敗，可能會導致假陽性。

二、溫度

溫度主要影響抗原抗體反應，酶促反應速度及非特異性吸附，溫度升高可使抗原抗體結合反應加速，但也易引起抗原抗體復合物的解離。酶促反應速度同樣隨溫度升高而增快，但是酶蛋白變性也加快，喪失酶學活性，降低酶的有效濃度而減慢反應速度，溫度低時以前者為主，高時以后者為主。

溫度是質量控制的一個重要方面，一般允許±1℃的誤差。最好水浴，微孔板浮在水面，使溫度迅速平衡。如放溫箱內溫育，微孔板不應疊置，為避免蒸發，板上應加蓋，盛放微孔板的濕盒應是金屬的，傳熱容易?？諠窈袘A先放在溫箱中，以平衡溫度，在室溫較低時更需要。

三、時間

在溫度保證的前提下，時間的控制至關重要，尤其是底物顯色的時間控制，顯色時間不足或過長會導致實驗不成立，無法對檢測結果進行判斷。

加人標本、試劑及混合的時間稱為操作時差。操作時差在每個試驗中都存在，對結果或多或少有影響。對手工操作，尤其是樣品量大的項目，從加人第一個標本到最后一個標本，需幾十分鐘，加人試劑及混勻存在很大的時間差異，使抗原抗體和酶促反應時間不一致，易產生假陽性、假陰性結果。

因此，樣品過多時，請選擇分批操作，對勿須更換移液口吸嘴的酶結合物，底物的加樣可選擇8聯或12聯專用的多道加液器。亦可避免單孔滴加底物時遺漏多加。

四、設備

儀器設備是ELISA實驗的基礎，常用的相關儀器設備包括移液器、酶標儀、洗板機和恒溫箱等。所有設備都需要進行檢驗校準，保證準確性和精確度。

移液器的使用要盡可能選擇所需加液量接近最大量程，并正確使用，減少實驗誤差。

酶標儀要提前開機預熱，保證光源穩定；洗板機要檢查加液孔是否通暢，保證加液量。

恒溫箱要提前開機，開、關門要快速，保證反應溫度。

五、顯色

顯色是ELISA中的最后一步反應,此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內,陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。

在定量測定中,加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴格控制,有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延。

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