免疫組化實(shí)驗(yàn)流程有哪些？

 你知道免疫組化實(shí)驗(yàn)流程有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、樣品制備

1. 組織固定：根據(jù)要求收集人或動(dòng)物的組織用于IHC分析，沖洗并用固定劑（一般用甲醛）進(jìn)行固定

2. 組織包埋：將經(jīng)甲醛固定的組織嵌入石蠟，以長期保持其天然形狀和組織結(jié)構(gòu)

3. 切片安裝：將組織樣品在切片機(jī)上切片，并轉(zhuǎn)移至載玻片上干燥保持其形態(tài)

4. 脫蠟水化：因切片上的石蠟會(huì)妨礙染色，所以需將切片上的石蠟溶出，并水化。脫蠟或水化不全容易造成非特異性背景著色（一般的脫蠟水化步驟是：將切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-無水乙醇5min-95%無水乙醇5min-90%無水乙醇5min-80%無水乙醇5min-70%無水乙醇5min-50%無水乙醇5min-蒸餾水5min×3，進(jìn)行脫蠟水化）。

5. 抗原修復(fù)：由于組織在甲醛固定過程中，蛋白之間發(fā)生了交聯(lián)及醛基的封閉從而掩蓋抗原決定簇?？梢酝ㄟ^高壓加熱修復(fù)抗原，使細(xì)胞內(nèi)抗原決定族暴露，從而提高抗原檢測率。

6. 非特定位點(diǎn)封閉：為了防止一抗的非特異性結(jié)合造成假陽性，可以選用BSA、羊血清等封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉血清來源一般與二抗保持一致，室溫封閉10-30min。

二、樣品染色

1. 一抗、二抗孵育：抗體孵育時(shí)間、溫度及濃度等因素對染色結(jié)果都存在很大影響。在4℃下反應(yīng)緩慢，背景較淺；37℃反應(yīng)較快時(shí)間較短；而室溫介于兩者之間，選擇室溫有利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。二抗一般室溫孵育30min。

2. 底物顯色：基于與酶綴合的二抗，抗原通過生色或熒光方式直接檢測。

3. 復(fù)染封片：組化染色后進(jìn)行復(fù)染可以襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，常用的復(fù)染劑有蘇木精、曙紅、甲基綠、DAPI和Hoechst熒光染色。觀察結(jié)束后使用中性樹膠進(jìn)行封片，可以長久保存。

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