免疫熒光實驗流程有哪些？

免疫熒光是一種常用的光學顯微術，即用熒光顯微鏡來觀察細胞中的特定生物分子。免疫熒光依賴于抗體抗原的特異性結合，然后通過直接標記或間接標記方法使用熒光分子指征抗體-抗原結合的位置，以確定目標生物分子在細胞中的位置、豐度和分布情況。那么你知道免疫熒光實驗流程有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

1. 固定

固定液種類：有機溶劑（甲醇、乙醇、丙酮等）；交聯劑（4%PFA、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決于被研究抗原的性質及所用抗體的特性。但針對磷酸化的抗體，不適合用甲醛，會導致磷酸蛋白從膜表面轉移到胞漿中，故應選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇，同時應注意甲醛會揮發，在4-8°C不宜儲存太久。

固定時間：取決于組合塊的大小和類型，對于大多數組織，18-24h較為理想，細胞固定時間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。

2. 透化

通透的目的是使抗體進入胞內。0.5% Triton X-100 室溫通透20 min（針對胞內抗原，若是細胞膜上表達的抗原則省略該步驟）；除了Triton X-100，丙酮也可作為通透劑，并且丙酮固定后的樣品不需要通透。

3. 封閉

封閉可減少一抗和二抗與非特異性位點結合。通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產生較高的背景。醛類固定的樣品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進行封閉。

4. 一抗孵育

根據一抗說明書，按照適當比例用一抗稀釋液稀釋一抗，用吸水紙吸盡封閉液，每張玻片滴加稀釋好的一抗并放入濕盒， 4℃孵育過夜。回收一抗，加入PBST， 在搖床上緩慢搖動洗滌5 min，共洗滌3次。

5. 熒光二抗孵育

用吸水紙吸盡洗滌液后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中孵育1h后，回收二抗，接著用PBST洗3次，每次5 min；由于熒光容易淬滅，故從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都要避光。

6. 復染核（定位的關鍵）

在玻片上滴加DAPI，并注意避光孵育5min，對標本進行染核，然后用PBST洗3次，每次5min，洗去多余的DAPI。

7. 封片

用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察。

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