CELLSCRIPT™體外加帽試劑盒工作原理

CELLSCRIPT™的使命是提供好的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品和技術(shù)，用于制造和使用RNA以便進(jìn)行臨床研究和治療的細(xì)胞翻譯。

目前的產(chǎn)品包括多種體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、加帽類似物或加帽酶的5' RNA加帽試劑盒和3' RNA多聚腺苷酸化的試劑盒，以及用于轉(zhuǎn)錄、加帽、poly(A)尾mRNA以進(jìn)行翻譯的多合一試劑盒。

其中，ScriptCap™ Cap 1 Capping System（C-SCCS1710）包含ScriptCap加帽酶、ScriptCap 2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶、GTP和SAM等成分，對體外轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加帽修飾。Cap 0或Cap 1上限均可構(gòu)建，效率接近100%（這不能通過共轉(zhuǎn)錄加帽方法來完成）。

ScriptCap加帽酶在體外催化具有5‘-三磷酸基的初級(jí)RNA的5’末端加成帽核苷酸。“帽核苷酸"或“帽"是一種鳥嘌呤核苷，它通過5‘C連接到一個(gè)三磷酸基團(tuán)，然后再連接到初級(jí)mRNA轉(zhuǎn)錄本中最多的5’核苷酸的5‘碳上，在大多數(shù)真核生物中，帽核苷酸中鳥嘌呤7位的氮是甲基化的。表示為：m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')。其中m7G代表N7-甲基鳥嘌呤核苷，PPP代表帽子核苷的5’碳與初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本的第一個(gè)核苷酸之間的三磷酸橋，N1(PN)x-OH(3’)代表初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本，其中N1是最多的5’核苷酸。

ScriptCap加帽酶可依次催化三種不同的酶反應(yīng)：

(1) RNA三磷酸酶將RNA的5‘三磷酸裂解成二磷酸：

pppN1(p)Nx-OH(3')——ppN1(pN)x-OH(3') + Pi

(2) RNA鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶將GTP連接到RNA最5‘核苷酸(N1)的5’二磷酸上：

ppN1(pN)x-OH(3') + GTP——G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + PPi

(3) 鳥嘌呤-7-甲基轉(zhuǎn)移酶以S-腺苷甲硫氨酸(SAM或ADOMet)為輔因子，催化帽核苷酸中鳥嘌呤7-氮的甲基化：

G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoMet——m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoHyc

這一過程被稱為“蓋帽"，與未蓋帽的RNA相比，它提高了RNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。ScriptCap蓋帽酶構(gòu)建的封端RNA產(chǎn)物具有“0"帽結(jié)構(gòu)。在體外，通過同時(shí)使用ScriptCap 2‘-O-甲基轉(zhuǎn)移酶和ScriptCap蓋帽酶，可以將CAP0 RNA轉(zhuǎn)化為“CAP1"結(jié)構(gòu)。

ScriptCap 2‘-O-甲基轉(zhuǎn)移酶通過將供體分子SAM上的甲基轉(zhuǎn)移到CAP 0 RNA倒數(shù)第二個(gè)核苷酸的2’-O位，從CAP 0-RNA制備CAP1-RNA，合成具有CAP 1結(jié)構(gòu)的RNA。

Cap1 RNA可以進(jìn)一步提高mRNA的體內(nèi)翻譯效率，并有助于將mRNA標(biāo)記為相對于細(xì)胞內(nèi)免疫監(jiān)視機(jī)制的“自身RNA"。

ScriptCap1蓋帽系統(tǒng)提供了一種在IVT反應(yīng)中通過共轉(zhuǎn)錄蓋帽來制造蓋帽RNA的替代方案，在IVT反應(yīng)中，用二核苷酸蓋帽類似物(例如m7GpppG)代替部分GTP，如果RNA的5‘末端不是結(jié)構(gòu)化的，使用ScriptCap 1蓋帽系統(tǒng)的蓋帽效率可以接近100%。相反，由于CAP類似物與GTP競爭RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，共轉(zhuǎn)錄的蓋帽效率受到CAP類似物的濃度及其與GTP濃度之比的限制。因此，在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用CAP類似物蓋帽的RNA百分比總是小于100%。在使用CAP類似物的共轉(zhuǎn)錄蓋帽反應(yīng)中可以產(chǎn)生的CAP RNA的量也受到降低GTP濃度以允許CAP類似物競爭轉(zhuǎn)錄起始的需要的限制。另一方面，如果要蓋帽的RNA具有高度結(jié)構(gòu)的5‘末端，則與CAP類似物共轉(zhuǎn)錄蓋帽可能是有益的。

優(yōu)勢：靈活進(jìn)行cap0和cap1的加帽；效率JI高，接近100％；同類產(chǎn)品可直接交叉使用以及價(jià)格合適。

應(yīng)用：進(jìn)行體外mRNA的修飾，用作體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)和生理試驗(yàn)；前體mRNA的研究試驗(yàn)以及疫苗研究。